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石蜡切片免疫组化和免疫荧光实验操作详解

发布时间:2019-07-23   点击次数:50次

石蜡切片免疫组化和免疫荧光实验操作详解

上海信帆生物提供免疫组化和免疫荧光实验代测。

一般流程

1。 用聚乙。烯亚胺或多聚赖氨酸涂覆盖玻片,在室温下放置 1 小时。

2. 用无菌水充分漂洗盖玻片 3 次,每次 1 小时。

3. 充分干燥盖玻片,在紫外光下灭菌至少 4 小时。

4. 使细胞在玻璃盖玻片上生长,或制备 Cytospin 或涂片制备物。

5. 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 简单漂洗。

推荐使用 1 × PBS 0.1% Tween 20 作为洗涤缓冲液。

固定

可使用以下两种方法中的一种固定细胞:

1. 室温下,在 100% 甲醇(-20 ℃ 冷冻)中孵育细胞 5 分钟。

2。 室温下,在 4% 多聚.甲醛(溶于 PBS 中,pH 7。4)中孵育细胞 10 分钟。

用冰 PBS 洗涤细胞 3 次。

抗原修复(可选步骤)

在抗原修复缓冲液对细胞进行加热处理后,有些抗体的效果会更好。查看产品信息,了解每种一抗的使用建议。

1。 将抗原修复缓冲液(100 mM Tris,5% [w/v] 尿素,pH 9。5)预热至 95 ℃。具体方法为:将装有缓冲液的盖玻片染色缸置于水浴锅中,水浴锅的温度设为 95 ℃。

2. 用小型宽头镊子小心将盖玻片置于盖玻片染色缸内的抗原修复缓冲液中,记下长有细胞的盖玻片面。

3. 在 95 ℃ 下加热盖玻片 10 分钟。

4. 从抗原修复缓冲液中取出盖玻片,浸

入 6 孔组织培养板内的 PBS 溶液中,保持长有细胞的一面朝上。

5. 用 PBS 洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

通透

如果靶蛋白位于细胞内,对细胞进行通透处理尤为关键。用丙.酮固定的样品不需要进行通透处理。

1. 用 PBS(含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin)孵育样品 10 分钟。Triton X-100 是用于提高抗体渗透性最常用的去垢剂。但 Triton X-100 会破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜抗原。

2. 确定每种目标蛋白的 Triton X-100 比例。

3。 用 PBS 洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

封闭与免疫染色

1. 用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育细胞 30 分钟,封闭抗体的非特异性结合(可替代的封闭液包括 1% 明胶或来源于产生二抗的物种的 10% 血清:查看抗体数据表了解相关建议)。

2. 室温下,用稀释抗体(溶于 1% BSA 的 PBST 中)在湿盒中孵育细胞 1 小时,或 4 ℃ 过夜孵育。

3。 倒出溶液,用 PBS 洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

4。 室温下,用二抗(溶于 1% BSA 中)避光孵育细胞 1 小时。

5. 倒出二抗溶液,用 PBS 避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

多色染色(可选步骤)

要检测同一个样品中两种或多种抗原的共同分布情况,需要使用双重免疫荧光流程。该流程可在混合物中同时进行检测,也可逐个抗原依次进行检测。

确保抗体来源于不同物种并且这些抗体有相应的二抗。例如,抗抗原 A 的兔抗体和抗抗原 B 的鼠抗体。也可使用偶联至不同荧光团的直标一抗。

同时孵育

1. 用封闭液孵育细胞 30 分钟。

2. 室温下,用两种一抗(溶于 1% BSA 的 PBST 中)在湿盒中孵育细胞 1 小时,或 4 ℃ 过夜孵育。

3。 倒出溶液,用 PBS 洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

4. 室温下,用两种二抗(溶于 1% BSA 中)避光孵育细胞 1 小时。

5. 倒出二抗溶液,用 PBS 避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

依次孵育

1。 第一封闭步骤:室温下,用第一封闭液(来源于产生二抗的物种的 10% 血清)孵育细胞 30 分钟。

2. 室温下,用第一种一抗(溶于 1% BSA 或 1% 血清的 PBST 中)在湿盒中孵育细胞 1 小时,或 4 ℃ 过夜孵育(一抗溶于 1% 明胶或 1% BSA 的 PBST 中)。

3. 倒出第一种一抗溶液,用 PBS 洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

4。 室温下,用第一种二抗(溶于 1% BSA 的 PBST 中)避光孵育细胞 1 小时。

5. 倒出第一种二抗溶液,用 PBS 避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

6。 第二封闭步骤:室温下,用第二种血清(来源于产生二抗的物种的 10% 血清)避光孵育细胞 30 分钟。

7. 室温下,用第二种一抗(溶于 1% BSA 或 1% 血清的 PBST 中)在湿盒中避光孵育细胞 1 小时,或 4 ℃ 过夜孵育。

8. 倒出第二种一抗溶液,用 PBS 避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

9. 室温下,用第二种二抗(溶于 1% BSA 中)避光孵育细胞 1 小时。

倒出第二种二抗溶液,用 PBS 避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。

如需检测两种以上的抗原,其余抗体按照步骤 1–5 继续操作。

复染

1。 用 0。1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI(DNA 染色)孵育细胞 1 分钟。

2. 用 PBS 漂洗细胞。

封片

1。 用一滴封片介质封闭盖玻片。

2。 用指甲油密封盖玻片,避免样品变干和在显微镜下移动。

3。 -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存

 

 

实验步骤

1.  石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟(3×3’)。

 

2.  取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’。(注:不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定)

 

3.  每张切片加1滴3%H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

 

4.  除去PBS液,每张切片加1滴相应的第一抗体(相应稀释倍数),室温下孵育2小时。

 

5。  PBS冲洗3×5’。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂,室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

 

6.  除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物,室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。

 

7.  除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺),显微镜下观察5分钟。

 

8.  苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。

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注意事项

1.  在切片加上一抗后,第二抗体标记多聚螯合物酶(HRP)的复合物与一抗结合,在多聚螯合物上有大量的HRP分子,使抗原信号有显著的放大,其敏感性较SABC、SP法高。

 

2.  由于多聚物在体内不存在,又不使用生物素,从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色,背景比SABC、SP法清晰。

 

3。  辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上,替代传统方法的 二抗、三抗,减少了实验步骤,且试剂孵育时间短,只需15分钟,使得免疫组化方法更简单,实验时间比SABC、SP法大为缩短。

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其他

一、特点

1.  在切片加上一抗后,第二抗体标记多聚螯合物酶(HRP)的复合物与一抗结合,在多聚螯合物上有大量的HRP分子,使抗原信号有显著的放大,其敏感性较SABC、SP法高。

2.  由于多聚物在体内不存在,又不使用生物素,从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色,背景比SABC、SP法清晰。

 

石蜡切片免疫组化和免疫荧光实验操作详解

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